Seja Bem Vindo ao Universo do Fibromiálgico

A Abrafibro - Assoc Bras dos Fibromiálgicos traz para você, seus familiares, amigos, simpatizantes e estudantes uma vasta lista de assuntos, todos voltados à Fibromialgia e aos Fibromiálgicos.
A educação sobre a Fibromialgia é parte integrante do tratamento multidisciplinar e interdisciplinar ao paciente. Mas deve se estender aos familiares e amigos.
Conhecendo e desmistificando a Fibromialgia, todos deixarão de lado preconceitos, conceitos errôneos, para darem lugar a ações mais assertivas em diversos aspectos, como:
tratamento, mudança de hábitos, a compreensão de seu próprio corpo. Isso permitirá o gerenciamento dos sintomas, para que não se tornem de difícil do controle.
A Fibromialgia é uma síndrome, é real e uma incógnita para a medicina.
Pelo complexo fato de ser uma síndrome, que engloba uma série de sintomas e outras doenças - comorbidades - dificulta e muito os estudos e o próprio avanço das pesquisas.
Porém, cientistas do mundo inteiro se dedicam ao seu estudo, para melhorar a qualidade de vida daqueles por ela atingidos.
Existem diversos níveis de comprometimento dentro da própria doença. Alguns pacientes são mais refratários que outros, ou seja, seu organismo não reage da mesma forma que a maioria aos tratamentos convencionais.
Sim, atualmente compreendem que a síndrome é "na cabeça", e não "da cabeça". Esta conclusão foi detalhada em exames de imagens, Ressonância Magnética Funcional, que é capaz de mostrar as zonas ativadas do cérebro do paciente fibromiálgico quando estimulado à dor. É muito maior o campo ativado, em comparação ao mesmo estímulo dado a um paciente que não é fibromiálgico. Seu campo é muito menor.
Assim, o estímulo dispara zonas muito maiores no cérebro, é capaz de gerar sensações ainda mais potencialmente dolorosas, entre outros sintomas (vide imagem no alto da página).
Por que isso acontece? Como isso acontece? Como definir a causa? Como interromper este efeito? Como lidar com estes estranhos sintomas? Por que na tenra infância ou adolescência isso pode acontecer? Por que a grande maioria dos fibromiálgicos são mulheres? Por que só uma minoria de homens desenvolvem a síndrome?
Estas e tantas outras questões ainda não possuem respostas. Os tratamentos atuais englobam antidepressivos, potentes analgésicos, fisioterapia, psicoterapia, psiquiatria, e essencialmente (exceto com proibição por ordem médica) a Atividade Física.
Esta é a parte que têm menor adesão pelos pacientes.
É dolorosa no início, é desconfortante, é preciso muito empenho, é preciso acreditar que a fase aguda da dor vai passar, trazendo alívio. Todo paciente precisa de orientação médica e/ou do profissional, que no caso é o Educador Físico. Eles poderão determinar tempo de atividade diária, o que melhor se adequa a sua condição, corrige erros comuns durante a atividade, e não deixar que o paciente force além de seu próprio limite... Tudo é comandado de forma progressiva. Mas é preciso empenho, determinação e adesão.
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segunda-feira, 5 de julho de 2021

Estudo científico: Transferência passiva de sintomas de fibromialgia de pacientes para camundongos

 

 

Andreas Goebel, 1,2 Emerson Krock, 3 Clive Gentry, 4 Mathilde R. Israel, 4 Alexandra Jurczak, 3 Carlos Morado Urbina, 3 Katalin Sandor, 3 Yuki Nomura, 3 Joana Menezes, 3 Azar Baharpoor, 3 Louisa Brieskorn, 3 Angelica Sandström, 5 Jeanette Tour, 5 Diana Kadetoff, 5,6 Lisbet Haglund,7 Eva Kosek,5,8 Stuart Bevan, 4 Camilla I. Svensson, 3 e David A. Andersson 4

Publicado em 1 de julho de 2021 - Mais informações

 

Abstrato

A síndrome da fibromialgia (SFM) é caracterizada por dor e sensibilidade generalizadas, e os pacientes geralmente experimentam fadiga e sofrimento emocional. A etiologia e fisiopatologia da fibromialgia não são totalmente explicadas e não existem tratamentos medicamentosos eficazes. Aqui, mostramos que a IgG de pacientes com SFM produziu hipersensibilidade sensorial ao sensibilizar neurônios nociceptivos. Os camundongos tratados com IgG de pacientes com FMS exibiram sensibilidade aumentada à estimulação mecânica e fria nociva, e as fibras nociceptivas em preparações de nervo da pele de camundongos tratados com FMS IgG exibiram uma maior responsividade ao frio e estimulação mecânica. Esses camundongos também apresentaram redução da atividade locomotora, redução da força de preensão da pata e perda da inervação intraepidérmica. Em contraste, a transferência de soro isento de IgG de pacientes com SFM ou de IgG de controles saudáveis ​​não teve efeito. O paciente IgG não ativou os neurônios sensoriais ingênuos diretamente. IgG de pacientes com SFM etiquetaram células gliais satélites e neurônios in vivo e in vitro, bem como tratos de fibras mielinizadas e um pequeno número de macrófagos e células endoteliais em gânglios da raiz dorsal de camundongos (DRG), mas nenhuma célula na medula espinhal. Além disso, FMS IgG ligou-se a DRG humano. Nossos resultados demonstram que a IgG de pacientes com SFM produz hipersensibilidades sensoriais dolorosas ao sensibilizar os aferentes nociceptivos periféricos e sugere que as terapias que reduzem os títulos de IgG do paciente podem ser eficazes para a fibromialgia. bem como tratos de fibras mielinizadas e um pequeno número de macrófagos e células endoteliais nos gânglios da raiz dorsal de camundongos (DRG), mas nenhuma célula na medula espinhal. Além disso, FMS IgG ligou-se a DRG humano. Nossos resultados demonstram que a IgG de pacientes com SFM produz hipersensibilidades sensoriais dolorosas ao sensibilizar os aferentes nociceptivos periféricos e sugere que as terapias que reduzem os títulos de IgG do paciente podem ser eficazes para a fibromialgia. bem como tratos de fibras mielinizadas e um pequeno número de macrófagos e células endoteliais nos gânglios da raiz dorsal de camundongos (DRG), mas nenhuma célula na medula espinhal. Além disso, FMS IgG ligou-se a DRG humano. Nossos resultados demonstram que a IgG de pacientes com SFM produz hipersensibilidades sensoriais dolorosas ao sensibilizar os aferentes nociceptivos periféricos e sugere que as terapias que reduzem os títulos de IgG do paciente podem ser eficazes para a fibromialgia.

Resumo Gráfico

resumo gráfico 

 


Introdução

A síndrome de fibromialgia (SFM) é uma condição de dor crônica caracterizada por dor generalizada, aumento da sensibilidade à dor à pressão mecânica e baixas temperaturas ( 1 -4 ), bem como fadiga e sofrimento emocional (5 -7 ). A prevalência de SFM é de pelo menos 2% (8 ), e aproximadamente 80% dos pacientes com SFM são mulheres. A prevalência aumenta para 10% -30% entre os pacientes com diagnóstico de doenças reumatológicas autoimunes (9 ,10 ), e a SFM é, portanto, uma das condições de dor crônica mais comuns. A etiologia e fisiopatologia da SFM não são completamente compreendidas (11 ) e as estratégias de tratamento atuais para SFM dependem principalmente de mudanças no estilo de vida, exercícios físicos e terapia medicamentosa com antidepressivos e anticonvulsivantes. Infelizmente, a eficácia modesta das terapias disponíveis na maioria dos pacientes deixa uma enorme necessidade clínica não atendida (12 ,13 ). Os modelos animais que foram usados ​​para estudos experimentais de SFM têm relevância translacional incerta e contam com injeções intramusculares repetidas locais de ácido (14 ) ou depleção sistêmica de monoaminas por tratamento com reserpina (15 ). O desenvolvimento de novas terapias baseadas em mecanismos tem sido dificultado pela compreensão limitada das bases da SFM.

O aumento da sensibilidade à dor polimodal experimentada por pacientes com SFM ( 1 ,16 ) está associado ao processamento alterado da dor no sistema nervoso central (11 ), modulação descendente disfuncional da dor (17 ,18 ), e mudanças estruturais e funcionais no cérebro (19 -21 ). A SFM também está associada a anormalidades em aferentes sensoriais periféricos, como atividade espontânea e sensibilização de fibras C e perda de inervação epidérmica (22 ,23 ). Níveis alterados de citocinas inflamatórias e imunorreguladoras também foram relatados em pacientes com SFM. Embora essas alterações não sigam um padrão consistente (24 ,25 ), eles podem sugerir que os processos imunológicos estão desregulados nos pacientes. Essas observações, juntamente com a prevalência acentuadamente elevada de SFM entre pacientes com doenças reumatológicas autoimunes (9 ,10 ), e demonstrações que menos comuns (26 ,27 ) e dores crônicas muito raras (28 ) são causados ​​por autoanticorpos, o que nos levou à hipótese de que a SFM pode ter uma base autoimune. Aqui, investigamos a possibilidade de que a IgG autorreativa seja responsável por vários sintomas-chave da SFM, examinando se eles podem ser transferidos para camundongos pela administração de IgG purificada de pacientes com SFM e avaliando a localização da IgG no tecido após a transferência passiva.

Resultados

Transferência passiva de hipersensibilidades sensoriais. IgG purificada a partir do soro de pacientes individuais com FMS e controles saudáveis ​​(HC) recrutados no Walton Centre (Liverpool, Reino Unido [UK]) foi administrada a camundongos fêmeas por injeção intraperitoneal durante 4 dias consecutivos (8 mg por dia). Este regime de dosagem foi baseado nos estudos originais que identificaram a miastenia gravis como um distúrbio mediado por autoanticorpos ( 29 ,30 ), e estudos mais recentes da síndrome de dor regional complexa (26 ,31 ). Porque FMS é caracterizada por hipersensibilidade à pressão mecânica, examinamos os limiares de retirada da pata em camundongos usando o teste de pressão da pata Randall-Selitto após a transferência de IgG. IgG de cada um dos 8 pacientes individuais, mas não de qualquer um dos 6 indivíduos com HC, rapidamente produziu hipersensibilidade mecânica ( Figura 1, A – F ). Além da sensibilidade à pressão, os pacientes frequentemente relatam que a dor é exacerbada por temperaturas frias, e o teste sensorial quantitativo demonstrou um aumento da sensibilidade à dor pelo frio na SFM (1 ,2 ,4 ,16 ). Em boa concordância com as observações dos pacientes, a administração de IgG de 7 dos 8 pacientes com SFM deu origem a um aumento significativo da sensibilidade ao frio nocivo em camundongos ( Figura 1, G – L ). As hipersensibilidades mecânica e ao frio foram tipicamente estabelecidas dentro de 24–48 horas após a primeira injeção e foram mantidas por mais de 1 semana. As hipersensibilidades observadas produzidas por preparações de IgG de diferentes pacientes com SFM mostraram amplitudes e cursos de tempo semelhantes ( Figura 1, A – L e Figura 1, A e B suplementar; material suplementar disponível online com este artigo; https://doi.org/ 10.1172 / JCI144201DS11), que se reflete nas sensibilidades mecânicas e ao frio médias produzidas por IgG a partir desses 8 pacientes individuais com SFM e 6 indivíduos com HC medidos ao longo de 10 dias ( Figura Suplementar 1, C e D ). FMS IgG também gerou hipersensibilidade à estimulação com filamentos de von Frey calibrados, um teste amplamente utilizado de nocicepção mecânica em camundongos ( Figura 2A ). Dor de fibromialgia é caracteristicamente generalizada, e estudos da localização corporal da dor identificaram a coxa como um dos locais mais comumente afetados (32 ,33 ). Portanto, examinamos a sensibilidade à pressão da coxa usando o dispositivo Randall-Selitto ( Figura 2B ), para determinar se FMS IgG afeta a sensibilidade à pressão de outros locais além da pata traseira em camundongos. Neste teste, FMS IgG produziu hipersensibilidade mecânica significativa na coxa em comparação com o tratamento com IgG de HCs ( Figura 2B ).


Transferência passiva de hipersensibilidades de pacientes com fibromialgia para camundongos.
figura 1

Transferência passiva de hipersensibilidades de pacientes com fibromialgia para camundongos. A administração de IgG (8 mg em 4 dias consecutivos) de cada um dos 8 pacientes com SFM diferentes (P1-P8) reduziu significativamente o limite de retirada no teste de pressão da pata ( A - F ) em comparação com IgG de indivíduos de controle saudáveis ​​(HC1-HC6 ) A latência de retirada da pata no teste da placa fria foi reduzida por IgG em 7 de 8 pacientes ( G - L ). Os pontos de dados são a média ± SEM de n = 6 camundongos em A , C , E , G , I e K ; n = 5 em D ,F, J e L ; e n = 4 em B e H . * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, FMS IgG em comparação com HC IgG; ANOVA de medida repetida de 2 vias seguida pela correção de Sidak.  P <0,05, †† P <0,01, ††† P <0,001, em comparação com o valor de pré-injeção ingênuo no tempo zero; ANOVA de medida repetida de 2 vias seguida pelo teste de Dunnett.

FMS IgG produz anormalidades polimodais.Figura 2

FMS IgG produz anormalidades polimodais. FMS IgG aumentou a sensibilidade à estimulação puntiforme com filamentos de von Frey ( A ). O limite para retirada da perna em resposta à pressão aplicada à coxa (usando um dispositivo Randall-Selitto) foi reduzido por FMS IgG em comparação com HC IgG ( B ). Camundongos fêmeas e machos são afetados igualmente por FMS IgG no teste de pressão da pata ( C ) e no teste de placa fria ( D ). Hipersensibilidade mecânica produzida por 1, 2 ou 4 injeções de 8 mg FMS IgG ( E ) e por injeções únicas de 2, 4 ou 8 mg ( F ). A força de preensão da pata dianteira é reduzida por FMS IgG em comparação com HC IgG ( G) Os pontos de dados são média ± SEM ou medições individuais. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, FMS IgG em comparação com HC IgG; ANOVA de medida repetida de 2 vias seguida pela correção de Sidak ( A , C , D e G ). Os dados em B foram analisados ​​pelo teste t bicaudal não pareado. Os dados em E e F foram comparados com o valor de pré-injeção naive no tempo zero por ANOVA de medida repetida de 2 vias seguida pelo teste de Dunnett.

 

A SFM é mais comum entre mulheres do que homens e, portanto, perguntamos se um aumento da sensibilidade aos efeitos da IgG contribui para o aumento da incidência em mulheres. Examinamos essa possibilidade comparando os efeitos da IgG de uma paciente do sexo feminino em camundongos fêmeas e machos. Observamos hipersensibilidades mecânicas e ao frio significativas e indistinguíveis em camundongos fêmeas e machos ( Figura 2, C e D ), sugerindo que é improvável que os achados comportamentais descritos sejam devidos ao aumento da sensibilidade feminina a FMS IgG.

Até então, administramos 4 injeções de 8 mg de IgG em todos os experimentos. Para identificar uma relação dose-resposta para IgG de um paciente, variamos o número de injeções diárias entre 1 e 4 ( Figura 2E ). Nesta experiência, 1, 2 e 4 injecções de 8 mg produziram padrões essencialmente idênticos de hipersensibilidade mecânica. Além disso, examinamos os efeitos de injeções únicas de 2, 4 e 8 mg de FMS IgG e descobrimos que apenas a dose mais alta aumentou a sensibilidade mecânica no teste de pressão da pata ( Figura 2F ). Esses dados sugerem que uma única injeção de 8 mg de IgG pode ser suficiente para transferir a hipersensibilidade mecânica para camundongos, e que o efeito é saturável ( Figura 2E ).

Uma vez que a SFM está regularmente associada à redução da força muscular, e a gravidade da SFM está negativamente correlacionada com a força de preensão manual ( 34 ,35 ), procuramos avaliar isso experimentalmente monitorando a força de preensão da pata dianteira em camundongos. Neste teste, FMS IgG reduziu significativamente a força de preensão em comparação com camundongos tratados com HC IgG ( Figura 2G ).

Para determinar se os anticorpos são responsáveis ​​por hipersensibilidades dolorosas em uma coorte maior e regionalmente distinta de pacientes com SFM (recrutados no Instituto Karolinska; Tabela Suplementar 1 ), examinamos os efeitos das preparações de IgG combinadas de vários pacientes com SFM e indivíduos com HC. Como esperado, os pacientes com SFM exibiram classificações de dor marcadamente mais altas em uma escala visual analógica (VAS) ( Figura 3A e Tabela suplementar 2 ) e um aumento significativo da sensibilidade à pressão-dor em comparação com indivíduos com HC ( Figura 3B e Tabela suplementar 2 ). Os níveis de isotipo IgG sérico de indivíduos com FMS e HC estavam dentro dos intervalos de concentração normais publicados (36 ) apesar de IgG1 ser menor no soro FMS do que no soro HC (para indivíduos suecos; Tabela Suplementar 3 ). A administração de IgG combinada de 2 grupos separados de pacientes com SFM a camundongos (8-14 indivíduos por grupo, 2 experimentos; Tabela suplementar 2 ) aumentou significativamente a sensibilidade no teste de pressão da pata em comparação com a administração de IgG combinada de grupos de indivíduos HC ( Figura 3C ). Nestes experimentos, usamos um regime de dosagem de 8 mg de IgG em 4 dias consecutivos. Semelhante às nossas observações com IgG de pacientes individuais ( Figura 1 ), o FMS IgG agrupado também induziu hipersensibilidade ao frio ( Figura 3D) Para determinar a duração da hipersensibilidade mediada por IgG em mais detalhes, estudamos os limiares mecânicos e as latências de frio em camundongos tratados com IgG combinada de pacientes ou indivíduos com HC por 1 mês. O início de hipersensibilidades produzidas por FMS IgG agrupado seguiu o mesmo curso de tempo visto com IgG de doadores individuais e se resolveu completamente cerca de 2,5 semanas após a interrupção da administração de IgG ( Figura 3, E e F ; ver Figura Suplementar 1 para curso de tempo com IgG de um paciente individual), o que é consistente com o curso de tempo para a eliminação de IgG humana de camundongos (37 ).


Transferência passiva de hipersensibilidade por IgG combinada de vários pacientes.
Figura 3

Transferência passiva de hipersensibilidade por IgG combinada de vários pacientes. Escores de dor visuais analógicos (VAS, A ) e limiares de dor à pressão (PPT, B ) em 2 grupos de pacientes com SFM e controles saudáveis ​​(HC). Piscina 1, n = 8 FMS e n = 12, HC; Conjunto 2, n = 14 FMS e n = 10 HC. ** P <0,01, *** P <0,001 pelo teste U de Mann-Whitney . A administração de IgG combinada de pacientes com SFM produziu hipersensibilidade mecânica ( C ) e fria ( D ) em camundongos em comparação com a combinação de HC IgG, 4 dias após a primeira injeção. Grupo 1, n= 6 camundongos por grupo; Conjunto 2, n = 12; linha e bigodes indicam média ± SEM. ** P <0,01, *** P <0,001 pelo teste t bicaudal não pareado. Decurso de tempo de hipersensibilidade mecânica ( E ) e fria ( F ) após a administração de IgG combinada (Grupo 1). * P <0,05, FM vs. HC IgG; ANOVA de medida repetida de 2 vias com correção de Sidak.  P <0,05, †† P <0,01, em comparação com o dia zero; ANOVA de medida repetida de 2 vias seguida pelo teste de Dunnett. Os dados em E e F são a média ± SEM de 6 camundongos por grupo.

Em seguida, comparamos os efeitos do IgG do paciente com SFM com o soro do paciente depletado de IgG do mesmo indivíduo para avaliar se as imunoglobulinas e os componentes do soro diferentes de IgG podem contribuir para a dor e a hipersensibilidade ( Figura 4 ). Como esperado, IgG de um paciente com SFM (8 mg em 4 dias consecutivos) produziu hipersensibilidades mecânicas e frias marcadas, mas o soro depletado de IgG do mesmo paciente e preparações combinadas de grupos de pacientes com SFM ou indivíduos com HC não apresentaram qualquer efeito comportamental discernível ( Figura 4, A e B ).


O soro isento de IgG é inativo.
Figura 4

O soro isento de IgG é inativo. IgG de um paciente com SFM, mas não o soro depletado de IgG do mesmo paciente ou agrupado de coortes de SFM ou HC, produziu hipersensibilidade mecânica ( A ) e fria ( B ). ** P <0,01, *** P <0,01, FM vs. HC IgG; ANOVA de medida repetida de 2 vias seguida pela correção de Sidak. Os pontos de dados são a média ± SEM de 6 camundongos por grupo.

IgG de pacientes reduz a atividade locomotora em camundongos. A fadiga, uma sensação de cansaço mental ou físico excessivo e fraqueza, é um dos principais sintomas da SFM ( 38 ), mas também de uma ampla gama de outras doenças crônicas (39 ). Pacientes com SFM costumam apresentar níveis reduzidos de atividade física (40 ), com uma perda de aptidão física como consequência (41 ). Incentivados pela demonstração de força de preensão reduzida após a administração de FMS IgG, examinamos a seguir a atividade locomotora de camundongos injetados com FMS IgG ou HC IgG por um período de 24 horas. Neste experimento, usamos IgG combinada de novos grupos de pacientes com SFM e indivíduos com HC (Grupo 3, Tabela Suplementar 2 ). Semelhante às 2 coortes anteriores (ver Figura 3, A e B ), os pacientes exibiram classificações de dor VAS mais altas e maior sensibilidade à pressão-dor em comparação com indivíduos com HC ( Figura 5, A e B , e Tabela Suplementar 2 ). Uma vez que os estudos de dose-resposta mostraram que 2 injeções de FMS IgG foram suficientes para induzir hipersensibilidade mecânica marcada (ver Figura 2), 8 mg de IgG agrupado foram injetados por via intraperitoneal em 2 dias consecutivos. Como esperado, os camundongos foram marcadamente menos ativos durante o dia do que durante a fase escura (18: 00-6: 00 horas), independentemente de terem recebido HC ou FMS IgG ( Figura 5C ). Durante a noite (18: 00-6: 00 horas, quando os ratos estão mais ativos), o número total de movimentos registrados em ratos tratados com FMS IgG foi reduzido. Quando examinado em mais detalhes, ficou aparente que essa redução foi predominantemente na fase mais ativa (22: 00–02: 00 horas; Figura 5, D – F ). Estes resultados demonstram que o FMS IgG afeta negativamente os comportamentos evocados e não evocados em camundongos.


A transferência passiva de FMS IgG diminui a atividade locomotora.
Figura 5

A transferência passiva de FMS IgG diminui a atividade locomotora. Pontuações de dor visual analógica (VAS, A ) e limiares de dor à pressão (PPT, B ) relatados por pacientes com SFM e indivíduos controle (HC) saudáveis ​​no Grupo 3. Após a transferência de HC ou FMS IgG para camundongos, a atividade locomotora foi avaliada durante um Período de 24 horas usando um Sistema de Monitoramento de Laboratório Animal Abrangente. O número total de movimentos registrados foi semelhante entre os camundongos HC IgG e FMS IgG durante a fase diurna (baixa atividade), mas os camundongos FMS IgG injetados mostraram menos atividade durante a fase noturna (alta atividade) ( C ). A fase noturna foi dividida em 3 fases: 18: 00–22: 00 horas ( D ), 22: 00–02: 00 horas ( E ) e 02: 00–06: 00 horas ( F), indicado pelas linhas pontilhadas. Os camundongos injetados com FMS IgG exibiram significativamente menos atividade locomotora durante a fase de pico de atividade ( E ) em comparação com os camundongos injetados com HC IgG. Os pontos de dados são média ± SEM, FMS n = 14, HC n = 11, n = 12 camundongos por grupo. * P <0,05, *** P <0,001 pelo teste U de Mann-Whitney ( A e B ), ANOVA de 2 fatores seguida pela correção de Bonferroni ( C ) ou teste t não pareado ( D - F ).

Sensibilização de nociceptores. A microneurografia de pacientes com SFM demonstrou sensibilização das fibras C nociceptivas ( 22 ). Para determinar se as anormalidades sensoriais demonstradas em camundongos in vivo após a administração de IgG de paciente com SFM podem ser explicadas por uma sensibilização de nociceptores periféricos, examinamos unidades de fibra aferente única em preparações de nervo safeno de pele de camundongos tratados com IgG. Unidades individuais foram classificadas de acordo com sua velocidade de condução e limiar de resposta mecânica, conforme descrito anteriormente (42 ,43 ).

Estimulamos os campos receptivos dos nociceptores mecanossensíveis Aδ e C (fibras AM e CM) mecanicamente e comparamos os limiares de ativação mecânica (a força necessária para eliciar pelo menos 2 potenciais de ação durante um desafio de 2 segundos) após 4 dias de tratamento com HC ou FMS IgG ( Figura 6, A – C ). Ambas as fibras AM e CM em preparações de camundongos tratados com FMS IgG responderam à estimulação mecânica com uma força reduzida em comparação com as preparações de camundongos tratados com HC IgG ( Figura 6, A – C ). Os limiares de resposta mecânica reduzidos são consistentes com a sensibilização de fibra C observada em pacientes com SFM usando microneurografia (22 ) e demonstrar que a IgG do paciente produz uma capacidade de resposta aumentada do nociceptor periférico que é mantida na ausência do sistema nervoso central. Uma vez que observamos uma robusta hipersensibilidade comportamental ao frio em camundongos tratados com FMS IgG, também examinamos se esse fenótipo foi acompanhado por um aumento da responsividade ao frio em fibras C mecanossensíveis ( Figura 6, D-F ). Desafiamos as fibras CM com uma rampa de resfriamento de 60 segundos (de 32 ° C a 5 ° C-9 ° C) e observamos que uma proporção maior de fibras CM respondeu ao frio em preparações de camundongos tratados com FMS IgG em comparação com HC IgG ( Figura 6D ). Em contraste, FMS IgG não influenciou os limiares de ativação de frio de CM sensível ao frio ( Figura 6E) Um número crescente de doenças humanas são reconhecidas como produzidas por autoanticorpos funcionais que alteram a excitabilidade pela ligação a proteínas de superfície neuronal (44 ). Portanto, desafiamos os neurônios isolados diretamente com uma alta concentração de FMS IgG (200 μg / mL), para determinar se FMS IgG excita diretamente os neurônios dos gânglios da raiz dorsal (DRG) por tal interação. Não observamos nenhum efeito de FMS IgG naconcentraçãointracelular de Ca 2+ ([Ca 2+ ] i ) em qualquer um dos 870 neurônios examinados ( Figura 6G ).


A transferência passiva de FMS IgG sensibiliza os nociceptores.
Figura 6

A transferência passiva de FMS IgG sensibiliza os nociceptores. Os limiares de ativação mecânica de ( A ) Aδ- (AM) e ( B ) C-mecanonociceptores (CM) foram reduzidos em preparações de camundongos tratados com FMS em comparação com HC IgG ( n = 22-27 unidades únicas). * P <0,05 pelo teste U de Mann-Whitney unilateral . ( C ) O traço de exemplo ilustra uma resposta de limiar mecânico (evocado pela força mínima necessária para eliciar pelo menos 2 picos) em uma unidade CM. ( D ) A proporção de unidades CM sensíveis ao frio (CMCs) foi aumentada em preparações de camundongos tratados com FMS IgG (21 de 29 unidades responderam ao frio) em comparação com HC IgG (13 de 28 unidades responderam ao frio). *P <0,05 pelo teste exato de Fisher unilateral. ( E ) Os limiares de ativação a frio das fibras CMC não diferiram entre as preparações FMS e HC ( n = 13–21). P > 0,05 pelo teste t unilateral. ( F ) O traço de exemplo ilustra uma resposta evocada a frio em uma fibra CMC. ( G ) A aplicação de FMS IgG (200 μg / mL) a neurônios DRG isolados carregados com Fura-2 não teve efeito sobre [Ca 2+ ] i em todos os 870 neurônios examinados (identificados por sua resposta a KCl 50 mM). O traço vermelho ilustra o curso médio de tempo dos 230 neurônios exibidos.

Localização imunohistoquímica in vivo de IgG humana. Uma vez que as fibras CM e AM eram hipersensíveis em camundongos tratados com FMS IgG, investigamos a localização de FMS IgG para entender melhor os possíveis locais de ação. Em camundongos injetados com IgG combinada, FMS IgG foi detectado consistentemente em DRG, mas nem no cérebro nem no tecido da medula espinhal por análise de Western blot ( Figura 7A ; ver blots não editados completos no material suplementar). A análise imunohistoquímica de tecidos de camundongos que foram injetados com FMS IgG agrupado, usando anticorpos IgG anti-humanos para detectar FMS IgG, revelou coloração robusta no DRG lombar ( Figura 7, B e C ), enquanto nenhuma imunorreatividade específica foi observada no medula espinhal ( Figura 7A eFigura suplementar 2A ). A porcentagem de área imunorreativa para IgG humana, bem como a intensidade de pixel, foi muito maior em camundongos que foram injetados com FMS IgG em comparação com IgG de indivíduos HC, e IgG anti-humano gerou apenas reatividade mínima em DRG de camundongos injetados com solução salina ( Figura 7, B e C ).

O FMS IgG se acumula no DRG e se liga às células gliais satélites.Figura 7

O FMS IgG se acumula no DRG e se liga às células gliais satélites. Após a injeção de IgG em camundongos, a análise de Western blot detectou FMS IgG no DRG, mas pouco ou nenhum IgG na medula espinhal (SC) ou cérebros ( A ) (IgG agrupado, 8 mg por dia durante 4 dias consecutivos, tecido coletado após a última injeção) . FMS IgG, mas não HC IgG, acumula-se no DRG 14 dias após a primeira injeção de IgG ( B e C ). IgG humana é vermelha e DAPI é azul. A imunorreatividade de IgG humana na área rica em neurônios foi quantificada avaliando a porcentagem da área que era imunorreativa para IgG humana e a intensidade média de pixel de IgG humana. A área percentual e a intensidade do pixel foram normalizadas para o sinal DAPI ( n = 9–10; os pontos de dados são mediana ± IC 95%). **P <0,01, *** P <0,001 por ANOVA de 1 fator seguido pelo teste post hoc de Tukey. A imunorreatividade de FMS IgG não se coloca com a coloração neuronal de NeuN, mas sim com as células gliais satélites (SGCs) (células que expressam glutamato sintase [expressando GS]), alguns macrófagos (células que expressam Iba1) e vasos sanguíneos (células que expressam CD31) , e tratos de fibra mielinizada (coloração de proteína básica de mielina [MBP]), mas não para fibras mielinizadas no DRG ( D) Para delinear ainda mais entre SGCs e membranas neuronais, a co-localização da imunorreatividade FMS IgG foi comparada com GS e TrkA (um receptor de membrana expresso por um subconjunto de nociceptores). FMS IgG co-localiza-se com SGCs que expressam GS (setas brancas), mas também pode se ligar raramente a membranas celulares neuronais TrkA-positivas (triângulos brancos) ( E ). As barras de escala indicam 50 μm, exceto a barra de escala da imagem de alta ampliação e a barra de escala em E , que indicam 25 μm.

A coloração de IgG do paciente com FMS foi localizada principalmente nas células gliais satélites (SGCs, visualizadas por coloração com glutamina sintase) e nos tratos de fibra que entram no DRG, bem como um pequeno número de macrófagos Iba1-positivos e vasos sanguíneos CD31-positivos ( Figura 7D ). O FMS IgG não pareceu co-localizar-se com o marcador nuclear neuronal NeuN, que marca os núcleos neuronais e, em menor extensão, o citoplasma. Uma vez que NeuN não rotula membranas neuronais e SGCs envolvem neurônios com apenas 20 nm de separação entre as células, foi um desafio distinguir a coloração da membrana neuronal daquela do SGC circundante ( Figura 7D) Exploramos ainda a possibilidade de que FMS IgG também rotule as membranas de neurônios sensoriais usando TrkA como um marcador de superfície neuronal. Além da extensa rotulagem de FMS IgG de SGCs que expressam glutamina sintase ( Figura 7, D e E ), FMS IgG também pareceu rotular alguns, mas não todos, neurônios que expressam TrkA ( Figura 7E ).

FMS IgG promove a expressão de marcadores de atividade de SGC. Uma vez que FMS IgG frequentemente co-localizou com SGCs, investigamos se isso estava associado a evidências de mudanças na atividade de SGC. Descobrimos que a área e o pixel positivo intensidade de glial fibrilar proteína ácida (GFAP) imunorreactividade ( Figura 8, A e B ) e GFAP e S100B expressão do gene ( Figura 8C ) em DRG de ratos injectados com FMS IgG foram aumentadas, em comparação com HC Controles injetados com IgG. Essas mudanças sugerem que a presença de FMS IgG em DRG aumentou a atividade de SGCs. Em contraste, a área percentual de Iba1 de imunorreatividade na área rica em neurônios do DRG não foi diferente entre os camundongos injetados com FMS IgG e HC IgG (Figura 8, D e E ), sugerindo que a acumulação de FMS IgG no DRG não estimulou a proliferação ou infiltração de macrófagos locais. No entanto, Aif1 (codificando Iba1) e Itagm (codificando CD11b) foram ambos elevados no DRG de camundongos FMS IgG injetados ( Figura 8F ), indicando que certos aspectos da atividade de macrófagos foram alterados por FMS IgG. É importante ressaltar que havia poucas ou nenhuma célula apoptótica no DRG de camundongos injetados com FMS ou HC IgG ( Figura Suplementar 3A ), indicando que os efeitos de FMS IgG não são devidos à morte de células neuronais. Em contraste com o DRG, nenhuma mudança na reatividade de astrócitos e microglia foi observada na medula espinhal com base em GFAP ( Figura Suplementar 2, B – D ) e Iba1 (Figura suplementar 2, E – G ) imunorreatividade, respectivamente. Juntos, esses resultados sugerem que FMS IgG tem um efeito local no DRG.


FMS IgG aumenta os sinais de atividade das células gliais satélites in vivo, mas não
Figura 8

FMS IgG aumenta os sinais de atividade das células gliais satélites in vivo, mas não estimula a inflamação sistêmica. DRG de camundongos injetados com FMS IgG aumentaram a imunorreatividade de GFAP ( A ), o que é indicativo de atividade aumentada de células gliais de satélite, em comparação com camundongos injetados com HC IgG quando a área percentual de imunorreatividade de GFAP e intensidade média de pixel de GFAP são quantificados e normalizados para o DAPI sinal ( B ). A expressão dos genes Gfap e s100b é elevada no DRG de camundongos injetados com FMS IgG em comparação com HC IgG ( C ). O número de macrófagos imunorreativos Iba1 permaneceu inalterado, assim como a área percentual de imunorreatividade Iba1, ao comparar camundongos injetados com HC IgG– e FMS IgG ( De E ). A expressão gênica de Aif1 (gene Iba1) e Itagm (gene para CD11b, outro marcador de macrófago) foi elevada em camundongos injetados com FMS IgG em comparação com camundongos injetados com HC IgG ( F ). Barras de escala: 50 μm. Os dados de qPCR foram normalizados para a expressão de Hprt1 analisada usando o método 2 –ΔΔCt . Níveis séricos de TNF ( G ), CXCL1 ( H ), IL-2 ( I ), IL-5 ( J ), IL-6 ( K ), IL-10 ( L ) e IFN-γ ( M) foram medidos e não houve diferenças entre os grupos. As linhas tracejadas indicam o limite inferior de quantificação (LLOQ) e as linhas tracejadas indicam o limite inferior de detecção ( G - M ). Linha e bigodes indicam média ± SEM ( n = 4–6). As diferenças entre FMS IgG e HC IgG foram analisadas com o teste U de Mann-Whitney ( B - F ). Os níveis de citocinas foram comparados entre solução salina, HC e FMS com ANOVA de 1 via seguida pelo teste post hoc de Tukey para cada analito ( G - M ), exceto IL-6, que não foi analisado estatisticamente porque a maioria dos valores estava abaixo do LLOQ. * P <0,05, ** P <0,01, ***P <0,001.

FMS IgG não induz a produção de citocinas ou inflamação sistêmica. Embora haja inconsistências entre os estudos publicados, os níveis de citocinas e quimiocinas inflamatórias e imunomoduladoras, como IL-6, IL-8 e IL-10, foram relatados como elevados no soro ou plasma da SFM ( 22 ,23 ) em comparação com HCs. Assim, avaliamos um painel de fatores no soro de camundongos injetados com FMS IgG, HC IgG ou solução salina. A IL-1β estava abaixo do limite de detecção em 5 das 6 amostras em cada grupo, indicando que nem FMS IgG nem HC IgG induziram a produção de IL-1β. Da mesma forma, não houve diferença nos níveis de TNF-α, CXCL1 (um análogo murino da IL-8 humana), IL-2, IL-5, IL-6, IL-10 e níveis de IFN-γ entre os grupos ( Figura 8 , G – M ). Estes dados demonstram que a injeção de FMS IgG não altera os níveis de citocinas inflamatórias e imunomoduladoras sistêmicas. Juntos, os resultados sugerem que o FMS IgG atua gerando um efeito local no DRG.

Ligação imunohistoquímica in vitro de FMS IgG. Para diferenciar ainda mais entre a marcação de SGCs e neurônios sensoriais, examinamos a imunorreatividade de FMS e HC IgG em culturas de células depletadas de neurônios sensoriais enriquecidas com SGC e culturas de células ricas em neurônios DRG dissociadas. FMS IgG ou HC IgG (pooled IgG, 100 μg / mL) foi adicionado ao meio de cultura antes da fixação das células para examinar a rotulagem da membrana em uma condição não permeabilizante. Em culturas enriquecidas com SGC, aproximadamente 75% das células eram SGCs glutamina sintase-positivas e menos de 0,5% eram neurônios. FMS IgG ligou-se a uma proporção significativamente maior de células (290 de 368 células analisadas, 79%) em comparação com HC IgG (84 de 264 células analisadas, 32%) ( Figura 9, A – C ), e reconheceu essas células mais fortemente, conforme julgado pela intensidade do pixel (Figura 9D ). Da mesma forma, FMS IgG marcou uma proporção significativamente maior de células glutamina sintase positiva (SGCs) e células negativas (não SGCs) nessas culturas e o fez com uma intensidade de pixel maior em comparação com HC IgG ( Figura 9, E e F ) .

O FMS IgG liga-se às células gliais satélites e aos neurônios in vitro.Figura 9

O FMS IgG liga-se às células gliais satélites e aos neurônios in vitro. As células vivas foram incubadas com FMS IgG ou HC IgG para examinar apenas a ligação à superfície celular. Em culturas de células gliais satélite (SGC) ( A ), FMS IgG marcou uma porcentagem maior de células do que HC IgG quando analisado por animal ( B ) e pelo número total de células ( C ). A imunorreatividade, analisada como intensidade de sinal (densidade integrada), foi maior nas células incubadas com FMS IgG do que com HC IgG ( D ). SGCs marcados com FMS IgG (GS + ) e não SGCs (GS - ) em maior extensão (porcentagem, E ) e com uma intensidade maior ( F ) do que HC IgG. Rotulagem de FMS e HC IgG de culturas neuronais (G ) não foi diferente quando considerada a porcentagem de células marcadas por animal ( H ), mas foi observada diferença quando considerado o número total de células ( I ). A intensidade do sinal foi maior para células expostas a FMS IgG do que HC IgG ( J ). Neurônios marcados com FMS IgG (βIII-tubulina + ) e não neurônios (βIII-tubulina - ) em maior extensão do que HC IgG ( K ). A intensidade do sinal de ligação de FMS IgG aos neurônios foi maior do que a ligação de FMS IgG a células não neuronais e a ligação de HC IgG a todas as células ( L ). Colocalização de FMS IgG e IB4 ( M) indica que FMS IgG se liga a membranas de células neuronais. Todas as barras de escala: 20 μm. Os pontos de dados são a porcentagem de células ligadas por HC ou FMS IgG ( B e H ). Em pontos de dados D , F , J e L são a densidade integrada de células individuais em 3 experimentos. Barras e bigodes indicam média ± SEM ( n = 3 experiências individuais). * P <0,05; *** P <0,001 pelo teste t não pareado ( B , D , H e J ), teste χ 2 ( C , E ,I e K ), ou teste de Kruskal-Wallis com o teste post hoc de Dunn ( F e L ).

Em culturas de neurônios DRG dissociados, aproximadamente 30% das células eram neurônios βIII-tubulina-positivos ( Figura 9G ). Semelhante às nossas observações com culturas enriquecidas com SGC, FMS IgG ligou-se a uma proporção maior de células de DRG dissociado (358 de 527 células analisadas, 68%) em comparação com HC IgG (158 de 469 células analisadas, 34%), e também marcou essas células com mais intensidade ( Figura 9, H – J ). É importante notar que o FMS IgG marcou quase todos os neurônios βIII-tubulina-positivos, enquanto o HC IgG marcou muito menos ( Figura 9K ). A intensidade de pixel da ligação de FMS IgG aos neurônios era maior do que a ligação de FMS IgG a células não neuronais e maior do que a ligação de HC IgG a neurônios e células não neuronais ( Figura 9L) Nem FMS IgG nem HC IgG afetaram a viabilidade celular em comparação com células que não foram incubadas com anticorpos ( Figura Suplementar 3, B – E ). Finalmente, a incubação de culturas vivas com IB4, um marcador de membrana de uma subpopulação de nociceptores, demonstrou que a ligação de FMS IgG co-localizou com membranas neuronais ( Figura 9M ). Em conclusão, FMS IgG se liga a SGCs in vivo, e enquanto outros estudos são necessários para determinar se FMS IgG também se liga a membranas neuronais in vivo, esta possibilidade é apoiada por nossos dados que mostram que FMS IgG se liga a SGCs e neurônios in vitro.

Inervação epidérmica reduzida. Um envolvimento de nervos sensoriais periféricos na SFM foi previamente indicado por observações de patologia de fibras pequenas em pacientes ( 23 ,45 ). É importante ressaltar que a gravidade dos sintomas de SFM está correlacionada com a extensão da patologia de fibras pequenas (33 ). Portanto, examinamos o impacto da IgG na densidade das fibras nervosas intraepidérmicas (IENFD) na pele da pata traseira glabra de camundongos. Uma redução significativa em IENFD foi aparente 14 dias após a administração de FMS IgG ter sido iniciada, em comparação com seções de pele de camundongos tratados de forma semelhante com HC IgG ( Figura 10, A e B ).

A transferência de FMS IgG diminui a densidade das fibras nervosas intraepidérmicas.Figura 10

A transferência de FMS IgG diminui a densidade das fibras nervosas intraepidérmicas. As fibras nervosas intraepidérmicas (IENFs) foram identificadas na pele da pata traseira glabra com um anticorpo anti-PGP 9.5 ( A ). O número de IENFs que cruzam da derme para a epiderme diminuiu após a transferência de FMS IgG em comparação com HC IgG 14 dias após a primeira injeção ( B ) (agrupados, 8 mg por dia durante 4 dias consecutivos). Barra de escala: 20 μm. Os pontos de dados são média ± SEM ( n = 7). * P <0,05 pelo teste t não pareado.

Rastreio da reatividade FMS IgG com fragmentos de proteína humana. Para investigar se FMS IgG de diferentes pacientes contém um padrão comum de autorreatividade, usamos uma tela de microarray em todo o proteoma (SciLifeLab). Este ensaio usa 42.000 peptídeos humanos (de> 18.000 proteínas) do Human Protein Atlas ( 46 ,47 ). Os péptidos na matriz são lineares, produzida em E . coli , e a maioria tem entre 50 e 150 aminoácidos de comprimento. Examinamos a reatividade de 4 amostras, cada uma preparada a partir de partes iguais de soros de 4 pacientes com SFM (4 × 4), e observamos que todas as 4 amostras reconheceram vários peptídeos (sinal> intensidade média de fluorescência + [4 × SD]; Tabela suplementar 5 ) No entanto, nossa análise também revelou que muito poucos peptídeos foram reconhecidos por mais de uma das amostras agrupadas, indicando fortemente que os antígenos incluídos na matriz provavelmente não representariam um autoantígeno comum em pacientes com SFM. Análise de super-representação ( http://webgestalt.org/ ; ref. 48) sugeriram algum grau de enriquecimento para proteínas associadas a termos de Ontologia Genética (GO) relacionados a componentes celulares e microtúbulos ( Tabela Suplementar 6 e Figura Suplementar 4 ), e um pequeno número de vias KEGG relacionadas ao metabolismo e ciclagem de vesículas ( Tabela Suplementar 7 e Figura suplementar 5 ).

O FMS IgG liga-se ao DRG humano. Finalmente, avaliamos se FMS IgG se liga a células em DRG humano. As secções DRG humanas foram incubadas com HC IgG ou FMS IgG agrupados e a intensidade e localização da ligação foram analisadas. FMS IgG ligou-se às células em DRG humano em maior extensão do que HC IgG, conforme avaliado pela intensidade de pixel ( Figura 11, A e B ). Além disso, FMS IgG se ligou a células imunorreativas GFAP e células imunorreativas NF200, indicando que FMS IgG se liga a SGCs humanos e neurônios sensoriais humanos ( Figura 11C ). O FMS IgG também marcou outras células, mas com menos intensidade. Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que FMS IgG contém anticorpos autorreativos que se ligam a antígenos expressos no DRG.


FMS IgG liga-se a DRG humano.
Figura 11

FMS IgG liga DRG humano. FMS IgG ligou-se a seções de tecido DRG humano mais intensamente do que HC IgG quando avaliado por densidade integrada normalizada para DAPI ( A e B ). A IgG é indicada em branco na linha superior e DAPI está no azul na fila inferior de um . Imagens de alta ampliação de FMS IgG (branco) demonstram co-localização (roxo) com células gliais satélite imunorreativas de GFAP (verde) e neurônios imunorreativos NF-200 (verde) ( C ). Barras de escala: 50 μm ( A ) e 20 μm ( C ). Os dados são a média ± SEM ( n = 5 lâminas coradas independentemente). *** P <0,001 pelo teste t não pareado.

Discussão

Aqui, demonstramos que várias características-chave da FMS podem ser induzidas em camundongos por IgG de indivíduos com FMS. A transferência de hipersensibilidades de pacientes para camundongos foi reproduzível em todos os indivíduos testados com SFM, sugerindo fortemente que os processos dependentes de anticorpos normalmente sustentam a sensibilidade característica e hipersensibilidades térmicas experimentadas pelos pacientes. O efeito pronociceptivo de IgG combinada mostra que amostras de diferentes pacientes têm atividade aditiva, uma vez que a IgG de cada doador nessas preparações foi diluída para níveis abaixo dos necessários para gerar hipersensibilidade em camundongos. As hipersensibilidades comportamentais produzidas por FMS IgG foram reversíveis em camundongos e normalmente resolvidas após 2-3 semanas, quando os níveis de IgG humana diminuíram ( 37) A redução na força de preensão e atividade locomotora espontânea e a densidade reduzida de inervação epidérmica observada em camundongos tratados com FMS IgG confirmam que, além de hipersensibilidades dolorosas, FMS IgG também produz vários sinais e sintomas não evocados de FMS. As preparações de soro isento de IgG não tiveram qualquer influência na nocicepção mecânica ou fria, confirmando que a IgG é o principal componente sérico patológico pró-nociceptivo em pacientes com SFM. É importante ressaltar que FMS IgG se liga a SGCs e neurônios em DRG de camundongo e humano, sugerindo fortemente que os pacientes com SFM têm anticorpos autorreativos.

As interações entre os sistemas nervoso e imunológico, e em particular os mecanismos autoimunes, têm atraído cada vez mais a atenção nos estudos da fisiopatologia das condições de dor crônica ( 49 ,50 ). Os efeitos pronociceptivos de autoanticorpos foram implicados na síndrome de dor regional complexa de condição pós-traumática incomum (31 ,51 ), onde a transferência passiva de IgG requer adicionalmente um trauma experimental para exercer seus efeitos pronociceptivos, ao contrário das observações apresentadas aqui para FMS IgG. Na neuromiotonia de condição neurológica muito rara e freqüentemente dolorosa, são comumente detectados autoanticorpos contra a proteína associada à contactina 2 (CASPR2) (28 ). A transferência passiva de IgG desses pacientes produz hipersensibilidades dolorosas ao internalizar canais de K + dependentes devoltagem. Nossos resultados indicam que processos não destrutivos semelhantes produzem hipersensibilidades, sintomas motores e perda de inervação epidérmica na SFM comum.

A importância da função alterada do sistema nervoso central e da plasticidade na SFM é ilustrada pelos padrões de atividade cerebral alterados ( 19 ), ativação da glia no cérebro (52 ), modulação da dor condicionada prejudicada (53 ), e hipersensibilidade multissensorial a uma ampla gama de estímulos (1 ,54 ,55 ). No entanto, está se tornando cada vez mais claro que as alterações periféricas também contribuem para a patologia subjacente, como exemplificado pela identificação da patologia de pequenas fibras em pacientes com SFM (33 ) e níveis alterados de citocinas (24 ). Aqui, descobrimos que os nociceptores mecanossensíveis em preparações de nervo cutâneo de camundongos tratados com FMS IgG exibiram uma maior responsividade a estímulos mecânicos e de frio, sugerindo fortemente que a hipersensibilidade dolorosa em FMS é produzida pela sensibilização de nociceptores periféricos. Em contraste, a aplicação direta de IgG a neurônios DRG isolados não teve efeito sobre [Ca 2+ ] i , consistente com uma ação indireta que pode envolver a atividade de um tipo de célula periférica adicional, como SGCs.

Em combinação com as observações eletrofisiológicas, a retenção de FMS IgG no DRG, a falta de IgG no cérebro e na medula espinhal e a ligação in vivo de FMS IgG a SGCs e neurônios sugerem fortemente que as ações pronociceptivas de FMS IgG foram impulsionadas por mecanismos periféricos. A ligação de FMS IgG em DRG humano e a ligação in vitro de FMS IgG à superfície de SGCs murinos e neurônios enfatiza ainda que os efeitos nociceptivos induzidos por FMS IgG podem resultar do reconhecimento de epítopos no DRG. Os sinais aumentados de atividade de SGC in vivo implicam que a ligação de FMS IgG no DRG tem efeitos funcionais. É claro que SGCs e neurônios sensoriais podem ser eletricamente acoplados e que tanto o acoplamento aumentado quanto as citocinas pronociceptivas derivadas de SGC podem influenciar a excitabilidade neuronal levando à hipersensibilidade ( 56-58 ). Além disso, o acúmulo de SGC e FMS IgG ligado a neurônios pode estimular alterações moleculares em macrófagos residentes em DRG que contribuem para a hipersensibilidade neuronal, apesar da falta de infiltração ou proliferação de macrófagos. Além disso, a ausência de aumentos sistêmicos em citocinas pró-inflamatórias como TNF e IL-1β ainda apóia nossa hipótese de que FMS IgG atua localmente no DRG, sem induzir uma resposta inflamatória sistêmica. Juntos, esses achados apontam para o DRG como um local de ação para FMS IgG e estudos futuros irão investigar as contribuições de IgG agindo em SGCs e neurônios na condução de anormalidades sensoriais relacionadas à dor e hipersensibilidades neuronais em camundongos.

Embora não tenhamos descoberto um padrão característico de reatividades no soro dos pacientes no microarray de proteínas, notamos um número substancial de autorreatividades. Nossos resultados também indicaram algum enriquecimento de reatividades contra proteínas classificadas em termos GO para componentes celulares e termos KEGG para vias relacionadas ao metabolismo. Embora o potencial enriquecimento de reatividades possa ser encorajador, sua relevância para a fisiopatologia da SFM não está clara atualmente, uma vez que foram detectados principalmente em amostras únicas. Além disso, a maioria das proteínas relevantes para os termos potencialmente enriquecidos estão localizadas intracelularmente e, portanto, são improváveis ​​de serem reconhecidas por IgG circulante. Autoantígenos genuínos também podem ter escapado da detecção,47 ). Os péptidos e fragmentos de proteínas foram produzidas em E . coli e, portanto, carecem de modificações pós-traducionais. A prevalência de reatividades contra peptídeos humanos em nossa avaliação preliminar de soros de pacientes é, no entanto, consistente com a IgG autorreativa sendo responsável por nossos achados. Curiosamente, o soro de pacientes com COVID-19 contém uma ampla gama de autoanticorpos funcionais, que foram propostos para influenciar o perfil sintomático dos pacientes ( 59 ).

Patologia de pequenas fibras nervosas e redução na inervação da pele foram observadas em pacientes com SFM e estão associadas a uma carga de doença mais grave e podem contribuir para a sensibilidade periférica ( 33 ). Notavelmente, observamos que a transferência de FMS IgG para camundongos resultou em uma redução de IENFD na pele da pata traseira glabra. Em humanos, ainda não está claro por que ocorre a redução da inervação da pele, mas nossos achados indicam que FMS IgG contribui para essa perda de fibra. FMS IgG pode conduzir a desnervação do DRG via SGC ou ligação ao corpo celular neuronal, mas também pode atuar mais distalmente por meio de outros mecanismos.

Estudos futuros examinarão os mecanismos celulares e moleculares subjacentes responsáveis ​​pela sensibilização periférica mediada por FMS IgG. A possibilidade de que o aumento da entrada periférica nociva produzida por FMS IgG pode gerar padrões alterados de atividade no sistema nervoso central ( 19) também precisa ser explorado. Da mesma forma, se FMS IgG impulsiona a sensibilidade a outras modalidades sensoriais, como estímulos auditivos e olfativos, ainda precisa ser investigado. A identificação de um papel fundamental para a IgG autorreativa na fisiopatologia da SFM pode transformar pesquisas futuras e facilitar o desenvolvimento de intervenções terapêuticas baseadas em mecanismo. Nossos resultados sugerem que as terapias que reduzem o título de IgG total, como plasmaférese ou imunoadsorção (por exemplo, com colunas de proteína A), ou que reduzem especificamente a IgG autorreativa (usando adsorção específica de antígeno) podem ser eficazes para SFM (60 ). Alternativamente, as terapias sintomáticas que interferem na ligação de anticorpos autorreativos ou evitam suas consequências funcionais também podem fornecer abordagens de tratamento eficazes.

Métodos

Design de estudo.Nosso objetivo era determinar se a administração de IgG de pacientes com SFM para camundongos transfere sintomas característicos da SFM. Pacientes com SFM e indivíduos com HC de mesma idade foram recrutados em 2 locais diferentes, a Universidade de Liverpool e o Instituto Karolinska, onde o soro foi coletado e o IgG foi purificado. Em primeiro lugar, avaliamos se a IgG de pacientes com SFM induziu um comportamento semelhante à dor em camundongos, transferindo IgG de um único indivíduo para camundongos, bem como transferindo IgG agrupada de vários indivíduos para camundongos. Em segundo lugar, investigamos se os aferentes sensoriais primários foram sensibilizados após a transferência de FMS ou HC IgG em camundongos usando uma preparação de pele-nervo ex vivo. Terceiro, examinamos a localização de FMS IgG após a transferência e a ligação do tipo de célula in vivo e in vitro com Western blotting e imunofluorescência. Durar, avaliamos as alterações induzidas por IgG na inervação da pele usando imunofluorescência. A hipersensibilidade mecânica é uma marca registrada da SFM e o teste de pressão da pata de Randall-Selitto é uma medida translacional sensível desse sintoma.

Cálculos de potência indicaram que n = 4 seria suficiente para detectar uma redução de 15 g do limiar de retirada da pata com α <0,025 e 1 - β> 0,9 (6 medidas repetidas, 2 lados), mas n= 6 para detectar uma redução na latência de retirada da pata da placa fria de 2,5 segundos. Os experimentos eletrofisiológicos foram analisados ​​usando testes unilaterais, uma vez que examinamos se o aumento da sensibilidade observada in vivo estava associado a um aumento (não diminuição) da responsividade de uma única unidade. Todos os outros dados foram analisados ​​por meio de testes bilaterais. Experimentos comportamentais (exceto o Comprehensive Animal Lab Monitoring System [CLAMS]) e eletrofisiológicos foram realizados no King's College London e CLAMS, imunofluorescência, Western blotting, qPCR e estudos de cultura de células foram realizados no Karolinska Institute. Experimentos de imunofluorescência, Western blotting e qPCR foram realizados com tecidos de experimentos comportamentais usando pools de IgG. Os experimentos de imunocitoquímica foram realizados usando pools de IgG.

Amostras de pacientes. Amostras de soro para testes individuais foram obtidas de pacientes do Reino Unido tratados para fibromialgia em um departamento de analgésicos ou de HCs de mesma idade e sexo entre abril de 2017 e novembro de 2018. Amostras agrupadas foram obtidas de pacientes suecos entre setembro de 2015 e dezembro de 2016 ou HCs que responderam a um anúncio de estudo entre março de 2016 e março de 2017. Todos os pacientes foram examinados por um reumatologista consultor e os pacientes do Reino Unido também foram examinados por um consultor em analgésicos.

Purificamos a IgG sérica de 44 pacientes com SFM e 39 indivíduos com HC. Todos os pacientes preencheram os critérios de diagnóstico ACR de 1990 e 2011 para fibromialgia ( 61 ,62 ). A maioria dos pacientes (42 de 44) e todos os doadores da amostra combinada não foram afetados por outras condições sensoriais, autoimunes ou reumatológicas. A maioria dos doadores de pacientes (43 de 44) eram mulheres. Os dados demográficos e as características da doença dos doadores são fornecidos nas Tabelas Suplementares 1 e 2 .

Purificação de imunoglobulinas. IgG para teste individual foi purificado conforme descrito anteriormente ( 63), usando esferas de proteína G (Sigma-Aldrich). O soro foi diluído 1: 3 com solução de Hartmann, passado através de uma coluna de proteína G e a IgG ligada foi eluída usando glicina 100 mM pH 2,3; após a eluição, o pH foi ajustado para 7,4 usando 1 M Tris pH 8 e, em seguida, o eluato foi dialisado durante a noite a 4 ° C em Hartmann usando uma membrana de diálise de 10 kDa (Thermo Fisher Scientific). A concentração de IgG presente após a diálise foi determinada usando um ensaio Lowry modificado (DC protein assay, Bio-Rad) e ajustada por diluição com Hartmann's ou por concentração de diálise contra uma solução de sacarose (Sigma-Aldrich). Finalmente, a solução de IgG foi esterilizada por filtração usando unidades de filtro de 0,2 μm acionadas por seringa (Millipore), armazenada a 4 ° C e usada dentro de 3 meses. Os soros para teste de amostra agrupada foram purificados usando colunas HiTrap Protein G HP (GE Healthcare), eluído com 0. Glicina 1 M / HCl pH 2,7, e o pH ajustado para 7,4 com Tris 1 M pH 9; consequentemente, as amostras foram dialisadas contra PBS, concentração ajustada, armazenadas a –20 ° C e, posteriormente, descongeladas, agrupadas e adaptadas à concentração usando colunas de concentração pré-úmida de PBS (Pall Corporation, Macrosep 10K); as medições de concentração foram realizadas usando um Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific). Antes de eluir o IgG da coluna de proteína G, os soros depletados de IgG (fluxo) foram coletados e armazenados a -80 ° C para uso posterior. Antes da injeção, o fluxo foi adaptado para concentração usando colunas de concentração pré-úmida de PBS e a concentração foi determinada com um Nanodrop 2000. e adaptado para concentração usando colunas de concentração pré-molhada de PBS (Pall Corporation, Macrosep 10K); as medições de concentração foram realizadas usando um Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific). Antes de eluir o IgG da coluna de proteína G, os soros depletados de IgG (fluxo) foram coletados e armazenados a -80 ° C para uso posterior. Antes da injeção, o fluxo foi adaptado para concentração usando colunas de concentração pré-úmida de PBS e a concentração foi determinada com um Nanodrop 2000. e adaptado para concentração usando colunas de concentração pré-molhada de PBS (Pall Corporation, Macrosep 10K); as medições de concentração foram realizadas usando um Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific). Antes de eluir o IgG da coluna de proteína G, os soros depletados de IgG (fluxo) foram coletados e armazenados a -80 ° C para uso posterior. Antes da injeção, o fluxo foi adaptado para concentração usando colunas de concentração pré-úmida de PBS e a concentração foi determinada com um Nanodrop 2000.

Animais. Os experimentos comportamentais foram realizados em camundongos fêmeas C57BL / 6J (8–10 semanas de idade) obtidos da Envigo UK Ltd e alojados em um ambiente de temperatura controlada com um ciclo de 12 horas de luz / 12 horas de escuridão com acesso a comida e água ad libitum . A avaliação da atividade locomotora e os experimentos de imunofluorescência foram realizados em camundongos BALB / c fêmeas de 4 meses de idade (Janvier). Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com IgG de indivíduos com HC ou pacientes com SFM em 1–4 dias consecutivos.

Estudos comportamentais. Antes de qualquer teste nociceptivo, os camundongos foram mantidos em suas gaiolas para se aclimatar (10-15 minutos) à sala experimental. Os camundongos foram distribuídos aleatoriamente entre as gaiolas e o experimentador desconhecia seu tratamento.

O teste de pressão da pata de Randall-Selitto foi realizado com um Analgesy-Meter (Ugo-Basile). O experimentador restringiu levemente o mouse e aplicou um estímulo de pressão constantemente crescente à superfície dorsal da pata traseira usando uma sonda cônica romba. O limiar nociceptivo foi definido como a força em gramas na qual o camundongo retirou sua pata ( 64 ). Um valor de corte de força de 150 g foi usado para evitar lesão do tecido. O teste de pressão na coxa também foi realizado com Analgesy-Meter. Uma pressão constantemente crescente foi aplicada ao músculo interno da coxa de camundongos levemente contidos, usando uma sonda romba em forma de cunha e a força na qual o camundongo retirou sua perna foi registrada como o limiar nociceptivo.

A sensibilidade tátil foi avaliada usando filamentos de von Frey (0,008–2 g) de acordo com o método up-down de Chaplan ( 65) Os animais foram colocados em uma câmara Perspex com um piso de grade de metal permitindo o acesso à sua superfície plantar e permitiu a aclimatação antes do início do experimento. Os filamentos de von Frey foram aplicados na superfície plantar da pata traseira com força suficiente para permitir que o filamento se dobrasse e mantidos estáticos por aproximadamente 2-3 segundos. O estímulo foi repetido até 5 vezes em intervalos de vários segundos, permitindo a resolução de quaisquer respostas comportamentais aos estímulos anteriores. Uma resposta positiva foi observada se a pata foi retirada bruscamente em resposta à aplicação do filamento ou se o camundongo se encolheu após a remoção do filamento. Qualquer movimento do mouse, como caminhar ou se limpar, foi considerado uma resposta pouco clara e, em tais casos, o estímulo foi repetido. Se nenhuma resposta for observada,

A sensibilidade térmica foi avaliada em placa fria (Ugo Basile). As latências de retirada da pata foram determinadas com a placa ajustada para 10 ° C. Os animais foram ligeiramente contidos (raspados) e a pata traseira esquerda foi colocada sobre a superfície da placa ( 66 ,67 ). A latência para retirada da pata foi registrada como o ponto final. Um corte máximo de 30 segundos foi usado para cada pata.

O desempenho da força de preensão do membro anterior foi avaliado usando um medidor de força de preensão disponível comercialmente (Ugo Basile), incorporando uma barra em T e um transdutor de força. Os ratos foram segurados suavemente pela base da cauda e puxados através da barra em T horizontal para que pudessem agarrar a barra com as patas dianteiras. Uma leitura digital da força máxima aplicada é fornecida assim que a empunhadura é liberada. Os camundongos foram aclimatados ao aparelho testando duas vezes antes de iniciar o estudo. O teste foi realizado pelo menos duas vezes em cada camundongo e o valor médio da força utilizado.

A atividade locomotora foi avaliada com gaiolas CLAMS (Columbus Instruments) por 48 horas. Os camundongos foram alojados individualmente e habituados às gaiolas por 24 horas, começando durante a noite, 4 dias após a injeção de anticorpos. Após a habituação, a atividade locomotora foi avaliada por registro de quebra de feixe. A gaiola CLAMS tem uma grade de feixes infravermelhos no plano x - y e registra as quebras do feixe infravermelho que resultam do movimento do mouse na gaiola. As quebras de feixe são contadas e usadas para avaliar o movimento total do mouse em um período de 24 horas. O movimento total é analisado pelo número de interrupções do feixe (contagens) em caixas de 20 minutos ao longo de um período de 24 horas. A fase noturna (fase de pico de atividade) foi subdividida em caixas de 4 horas, das 18h às 6h.

Registro do nervo da pele. Os camundongos foram mortos por deslocamento cervical e a pata traseira foi raspada antes da dissecção da preparação de pele-nervo isolada. O nervo safeno e a pele raspada do membro posterior foram colocados em uma câmara de registro a 32 ° C. A câmara foi perfundida com um fluido intersticial sintético (SIF) gaseificado (95% O 2 e 5% CO 2 ): 108 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0,7 mM MgSO 4 , 26,2 mM NaCO 3 , 1,65 mM NaH 2 PO 4 , CaCl 2 1,53 mM, Gluconato de sódio 9,6 mM, glicose 5,55 mM e sacarose 7,6 mM. A pele foi colocada de dentro para cima (lado do cório para cima) e fixada com alfinetes de inseto (0,2 mm de diâmetro) no banho de órgãos para permitir o acesso aos campos receptivos. O nervo safeno foi enfiado através de uma pequena lacuna do banho de órgãos para uma câmara de registro adjacente e posicionado em uma plataforma de espelho. O nervo safeno dessecado foi coberto com óleo de parafina para isolamento elétrico e os filamentos nervosos dissecados foram visualizados com um microscópio e colocados em um eletrodo de registro de fio de ouro ( 42 ,43 ).

Velocidade de condução. O nervo safeno foi dividido em filamentos progressivamente mais finos até que uma única unidade pudesse ser isolada em resposta à estimulação mecânica do campo receptivo com uma haste de vidro. A latência elétrica das unidades identificadas (Digitimer DS2, Digitimer Ltd) foi usada para determinar a velocidade de condução e categorizar as unidades como Aβ (velocidade> 10 m / s), Aδ (1,2 <velocidade <10 m / s) ou C- fibras (0 <velocidade <1,2 m / s).

Estimulação mecânica e fria.Uma sonda de estimulação controlada por computador, equipada com um transdutor de força, foi usada para fornecer estímulos mecânicos ao ponto mais sensível de um campo receptivo (Avere Solutions UG) de fibras AM e CM em preparações de camundongos tratados com FMS ou HC IgG. A gravação e análise foram feitas usando Spike 2 (Cambridge Electronic Design). A sensibilidade ao frio de unidades CM foi investigada isolando o campo receptivo com um anel de metal e uma rampa de frio de 60 segundos (~ 31 ° C-4 ° C) foi aplicada por superfundir SIF pré-resfriado. Bombas peristálticas foram usadas para controlar a taxa de fluxo SIF. Uma sonda digital de temperatura (GIA 2000, Greisinger) foi colocada dentro do anel para registrar a temperatura na pele.

Imunofluorescência.Os camundongos foram profundamente anestesiados com isoflurano e perfundidos com PBS, seguido por 4% de paraformaldeído (PFA). A medula espinhal lombar, o DRG lombar e a pele glabra da pata traseira foram coletados, pós-fixados por 24 horas em 4% de PFA, crioprotegidos em sacarose 20% e, em seguida, incluídos em um composto de temperatura de corte ideal (OCT) (Sakura Finetek). O tecido foi seccionado com um criostato CryoStar NX70 (Thermo Fisher Scientific) em uma espessura de 10 μm e descongelado montado em lâminas SuperFrost Plus (Thermo Fisher Scientific) e as lâminas foram armazenadas a –20 ° C até o uso. Antes do uso, as lâminas foram descongeladas por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente e lavadas em PBS para remover o excesso de OCT. As lâminas foram bloqueadas com PBS suplementado com 0,3% de Triton X-100 e 3% de soro normal de cabra ou burro, dependendo do anticorpo secundário, e então incubados com anticorpos primários diluídos em PBS suplementado com 0,1% de Triton X-100 e 1% de soro normal de cabra ou burro. As lâminas foram lavadas e incubadas com anticorpos secundários apropriados (indicados emTabela complementar 4 ). Para estudos de co-localização de IgG humana com vários marcadores de tipo de célula, os anticorpos primários contra os marcadores de tipo de célula foram adicionados primeiro e, em seguida, após a lavagem, o anticorpo IgG anti-humano foi coincubado com os anticorpos secundários contra os anticorpos primários de marcador de tipo de célula . Após a lavagem, as lâminas foram incubadas com DAPI (1: 20.000), lavadas novamente e, em seguida, cobertas com uma lamela com meio de montagem Prolong Gold (Thermo Fisher Scientific).

Um DRG humano foi coletado de uma mulher de 53 anos sem histórico de dor crônica que morreu após um traumatismo craniano. O DRG foi congelado rapidamente no momento da coleta e armazenado a -80 ° C até ser incorporado em OCT. O tecido foi seccionado com uma espessura de 14 μm e montado em lâminas SuperFrost Plus e armazenado a –80 ° C até o uso. Para a coloração, as seções foram fixadas por 30 minutos com PFA a 4% frio, lavadas com PBS, bloqueadas com PBS suplementado com Triton X-100 a 0,3% e soro de cabra normal a 3% por 1 hora e incubadas durante a noite com 100 μg / mL de anti não conjugado –Fragmentos Fab de IgG humana (H + L, Jackson Immunoresearch). Após a lavagem, as lâminas foram incubadas durante a noite com FM ou HC IgG (15 μg / mL) diluídos em PBS com 1% de soro de cabra normal e 0,1% de Triton X-100. As lâminas foram então lavadas e incubadas com anticorpos secundários apropriados por 2 horas. Os anticorpos contra NF200 ou GFAP foram aplicados por 2 horas e, em seguida, as lâminas foram lavadas e incubadas com anticorpos secundários apropriados. Após a lavagem, as lâminas foram incubadas com DAPI (1: 10.000), lavadas novamente e, em seguida, cobertas com uma lamela com meio de montagem Prolong Gold.

Microscopia e análise de fluorescência.DRG foram fotografados usando um microscópio confocal (Zeiss LSM800) operado pelo software LSM ZEN2012 (Zeiss). A acumulação de IgG humana e a intensidade do sinal GFAP e Iba1 foram analisadas no ImageJ (NIH) definindo uma região de interesse em torno da área rica em neurônios do DRG, aplicando um limite mínimo de intensidade de pixel e, em seguida, a área positiva percentual acima do limite e o intensidade média de pixel acima do limiar foi avaliada. Os dados foram então normalizados para a intensidade do pixel DAPI. O número de macrófagos foi calculado contando o número de células Iba1-imunorreativas na área rica em neurônios do DRG. O IENFD foi determinado pela contagem do número de fibras que cruzam da derme à epiderme. As medulas espinhais foram fotografadas usando um microscópio de fluorescência Nikon Eclipse TE300 com uma câmera Nikon Digital Sight DS-Fi1. A intensidade do sinal Spinal Iba1 e GFAP foi analisada por 2 revisores cegos usando um script Python desenvolvido sob medida. Os dados foram então normalizados para a intensidade do pixel DAPI. Para DRG e medula espinhal, 4-5 seções de cada animal, separadas por pelo menos 50 μm, foram analisadas e calculadas a média para cada experimento. Para a pele, 4 seções de cada animal separadas por pelo menos 80 μm foram analisadas e calculadas a média. Os dados são apresentados como média ± SEM. Imagens representativas da medula espinhal foram obtidas usando um microscópio confocal Zeiss LSM 800. 4 seções de cada animal separadas por pelo menos 80 μm foram analisadas e calculadas. Os dados são apresentados como média ± SEM. Imagens representativas da medula espinhal foram obtidas usando um microscópio confocal Zeiss LSM 800. 4 seções de cada animal separadas por pelo menos 80 μm foram analisadas e calculadas. Os dados são apresentados como média ± SEM. Imagens representativas da medula espinhal foram obtidas usando um microscópio confocal Zeiss LSM 800.

Cultura de células. Culturas enriquecidas com DRG e SGC / depletadas de neurônios foram estabelecidas usando um protocolo modificado baseado em Malin et al. ( 68) Resumidamente, aproximadamente 40 DRG foram coletados de cada camundongo e digeridos enzimaticamente em papaína (Worthington Biochemical Corp.) por 30 minutos e depois em uma mistura de Colagenase II (Worthington Biochemical Corp.) / Dispase (Sigma-Aldrich) por 30 minutos. Após a digestão, as células foram suspensas em meio F-12 (Gibco) com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco) e 1 × penicilina-estreptomicina (Gibco). A trituração suave foi usada para formar uma suspensão de uma única célula. Culturas DRG que foram usadas para a coloração de neurônios foram semeadas em lâminas de câmara tratadas com Nunc Lab-Tek II CC2 (Thermo Fisher Scientific). Culturas enriquecidas com SGC / depletadas de neurônios foram estabelecidas semeando células em lâminas de câmara Nunc Lab-Tek de vidro não revestido e 1,5 horas após a semeadura do meio e células não aderentes, incluindo neurônios, foram removidas; as células aderentes foram lavadas uma vez com meio fresco e meio fresco foi então adicionado às células aderentes. As culturas foram mantidas em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO2 . As culturas foram deixadas a recuperar durante aproximadamente 20 horas antes da imunocitoquímica ou coloração TUNEL.

Reagentes. Todos os tampões e sais foram adquiridos da Sigma-Aldrich, VWR ou Thermo Fisher Scientific.

Estatisticas. Os dados são apresentados como pontos de dados individuais ou como média ± SEM, a menos que indicado de outra forma, e o número de animais ou unidades individuais estudadas são indicados por n . Outliers na análise de densidade integrada de imunofluorescência foram removidos usando o teste ROUT; caso contrário, nenhum ponto de dados foi removido de qualquer um dos conjuntos de dados apresentados. Os dados de experimentos comportamentais in vivo, a maioria dos dados de imunofluorescência in vivo e in vitro e os dados de qPCR foram avaliados estatisticamente por teste t bicaudal não pareado, teste de Mann-Whitney, ANOVA de medida repetida de 2 vias seguido por teste post hoc de Sidak ou Dunnett ou ANOVA de 1 fator seguido do teste post hoc de Tukey. Os dados do paciente e os dados eletrofisiológicos foram avaliados por Mann-Whitney Uteste. As diferenças na distribuição das células ligadas por FMS ou HC IgG foram avaliadas pelo teste χ 2 . As comparações com um valor P inferior a 0,05 foram consideradas estatisticamente diferentes.

Aprovação do estudo. A coleta de soro recebeu aprovação ética (Reino Unido: Ethics North-West Haydock, ref. 15 / NW / 0467; Suécia: aprovada pelo comitê de ética local 2011 / 2036–31 / 1) e as amostras foram coletadas de indivíduos após consentimento informado por escrito. Um DRG humano foi coletado de um doador de órgãos após consentimento do parente mais próximo e recebeu aprovação do conselho de revisão institucional (McGill University Health Center REB 2019-4896). Os experimentos comportamentais foram realizados de acordo com a Lei de Procedimentos de Animais do Home Office do Reino Unido (1986). Todos os procedimentos no Reino Unido foram aprovados pelo Corpo de Bem-Estar Animal e Revisão Ética do King's College London e conduzidos sob uma Licença de Projeto de Home Office do Reino Unido. Os experimentos com animais na Suécia foram aprovados pelo Stockholm North Animal Ethics Board (4945-2018).

Contribuições do autor

AG concebeu e iniciou os estudos no Reino Unido, projetou e conduziu os aspectos clínicos de Liverpool e contribuiu com o projeto experimental e com a redação do manuscrito. E Krock concebeu, projetou, executou e analisou experimentos de cultura de células, realizou medições de citocinas e IgG no sangue, analisou a ligação de IgG, mRNA e proteína de DRG de camundongo e escreveu o manuscrito. CG projetou, executou e analisou experimentos comportamentais. A ressonância magnética projetou, realizou e analisou experimentos eletrofisiológicos e contribuiu para a redação do manuscrito. AJ realizou e analisou experimentos de cultura de células, analisou experimentos imuno-histoquímicos e auxiliou no processamento de amostras de pacientes. CMU projetou e realizou experimentos para análise imuno-histoquímica de pele de camundongo e DRG humano. KS realizou e analisou experimentos comportamentais e imunohistoquímicos e auxiliou no processamento de amostras de pacientes. NV projetou, executou e analisou experimentos eletrofisiológicos. MM realizou e analisou experimentos e contribuiu na redação do manuscrito. A UC realizou e analisou experimentos eletrofisiológicos. SS realizou preparações de amostras de ensaio de Liverpool e contribuiu para escrever o manuscrito. YN realizou e analisou experimentos de cultura de células. JM realizou e analisou cultura de células e experimentos em camundongos, experimentos imunohistoquímicos DRG e IgG purificada de amostras de pacientes. IgG purificada AB de amostras de pacientes. LB realizou e analisou experimentos imuno-histoquímicos. AS examinou a coorte de Estocolmo, incluindo testes sensoriais quantitativos. JT rastreou controles saudáveis ​​na coorte de Estocolmo e examinou a coorte de Estocolmo, incluindo testes sensoriais quantitativos e amostragem de sangue. DK realizou triagem e diagnóstico da coorte de Estocolmo e coleta de sangue. LH coordenou coleta DRG humana de doadores de órgãos. E Kosek desenhou e coordenou os aspectos clínicos do estudo em Estocolmo e contribuiu na redação das partes clínicas do manuscrito. CIS iniciou os estudos suecos e SB, CIS e DAA conceberam os estudos, projetaram e analisaram experimentos e escreveram o manuscrito. Todos os autores participaram da leitura crítica do manuscrito e deram seu consentimento para a redação final. A ordem dos co-primeiros autores, AG e E Krock, foi determinada em ordem alfabética. DK realizou triagem e diagnóstico da coorte de Estocolmo e coleta de sangue. LH coordenou coleta DRG humana de doadores de órgãos. E Kosek desenhou e coordenou os aspectos clínicos do estudo em Estocolmo e contribuiu na redação das partes clínicas do manuscrito. CIS iniciou os estudos suecos e SB, CIS e DAA conceberam os estudos, projetaram e analisaram experimentos e escreveram o manuscrito. Todos os autores participaram da leitura crítica do manuscrito e deram seu consentimento para a redação final. A ordem dos co-primeiros autores, AG e E Krock, foi determinada em ordem alfabética. DK realizou triagem e diagnóstico da coorte de Estocolmo e coleta de sangue. LH coordenou coleta DRG humana de doadores de órgãos. E Kosek desenhou e coordenou os aspectos clínicos do estudo em Estocolmo e contribuiu na redação das partes clínicas do manuscrito. CIS iniciou os estudos suecos e SB, CIS e DAA conceberam os estudos, projetaram e analisaram experimentos e escreveram o manuscrito. Todos os autores participaram da leitura crítica do manuscrito e deram seu consentimento para a redação final. A ordem dos co-primeiros autores, AG e E Krock, foi determinada em ordem alfabética. e contribuiu na redação das partes clínicas do manuscrito. CIS iniciou os estudos suecos e SB, CIS e DAA conceberam os estudos, projetaram e analisaram experimentos e escreveram o manuscrito. Todos os autores participaram da leitura crítica do manuscrito e deram seu consentimento para a redação final. A ordem dos co-primeiros autores, AG e E Krock, foi determinada em ordem alfabética. e contribuiu na redação das partes clínicas do manuscrito. CIS iniciou os estudos suecos e SB, CIS e DAA conceberam os estudos, projetaram e analisaram experimentos e escreveram o manuscrito. Todos os autores participaram da leitura crítica do manuscrito e deram seu consentimento para a redação final. A ordem dos co-primeiros autores, AG e E Krock, foi determinada em ordem alfabética.

Material suplementar
Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela concessão MR / S003428 / 1 do Medical Research Council (para DAA, SB e AG), Versus Arthritis grant 21544 (para DAA e AG) e 21543 (para SB), a Pain Relief Foundation Liverpool (para DAA , SS e AG), Eli Lilly & Co (para DAA), bolsa do Swedish Research Council 542-2013-8373 (para CIS), Knut and Alice Wallenberg Foundation (018.0161 para CIS), Karolinska Institute Foundations (para CMU) , Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7 / 2007–2013) ao abrigo do acordo de subvenção número 602919 (para CIS e E Kosek), Programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do Acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie número 764860 (para CIS e E Kosek), o Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) no âmbito do programa de pesquisa e inovação Horizonte 2020 da União Europeia, ao abrigo do acordo de subvenção no. 866075 (para CIS), por uma doação generosa de Leif Lundblad e família (para CIS e E Kosek), Conselho do Condado de Estocolmo (conceder ALF-20190039 para E Kosek), a bolsa da IASP John J. Bonica (para E Krock), uma bolsa de pós-doutorado do CIHR (MFE- 171299 para E Krock), e o Konung Gustaf V: s 80-årsfond (para E Krock). Os autores agradecem a Domenico Cozzetto da Translational Bioinformatics Platform no NIHR Biomedical Research Centre da Guy's e St. Thomas's NHS Foundation Trust e King's College London pelos conselhos de bioinformática. O resumo gráfico foi criado com BioRender e o Programa de Pesquisa Estratégica em Diabetes no Karolinska Institutet forneceu acesso ao sistema CLAMS. uma bolsa de pós-doutorado do CIHR (MFE-171299 para E Krock), e o Konung Gustaf V: s 80-årsfond (para E Krock). Os autores agradecem a Domenico Cozzetto da Translational Bioinformatics Platform no NIHR Biomedical Research Centre da Guy's e St. Thomas's NHS Foundation Trust e King's College London pelos conselhos de bioinformática. O resumo gráfico foi criado com BioRender e o Programa de Pesquisa Estratégica em Diabetes no Karolinska Institutet forneceu acesso ao sistema CLAMS. uma bolsa de pós-doutorado do CIHR (MFE-171299 para E Krock), e o Konung Gustaf V: s 80-årsfond (para E Krock). Os autores agradecem a Domenico Cozzetto da Translational Bioinformatics Platform no NIHR Biomedical Research Centre da Guy's e St. Thomas's NHS Foundation Trust e King's College London pelos conselhos de bioinformática. O resumo gráfico foi criado com BioRender e o Programa de Pesquisa Estratégica em Diabetes no Karolinska Institutet forneceu acesso ao sistema CLAMS.

Notas de rodapé

Conflito de interesse: DAA recebeu apoio de pesquisa da Eli Lilly & Co.

Copyright: © 2021, Goebel et al. Este é um artigo de acesso aberto publicado sob o

termos da Licença Internacional Creative Commons Atribuição 4.0.

Informações de referência: J Clin Invest . 2021; 131 (13): e144201.https: //doi.org/10.1172/JCI144201.

Veja o comentário relacionado em From human to mouse and back oferece esperança para pacientes com fibromialgia .

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Observação 2: Tabelas e imagens não foram traduzidos

 

 

fonte: https://www.jci.org/articles/view/144201?key=51bf6d85e305f6b62f87#SEC4